Введение

Критическая роль кости в скелетной системе становится особенно очевидной в контексте травм, вызванных травмой, врожденными аномалиями, опухолями или возрастной дегенерацией [1].Такие состояния часто приводят к потере костной ткани, снижение грузоподъемности и снижение защиты внутренних органов [2].Реконструкция этих дефектов остается одной из самых сложных, дорогостоящих,и болезненные процедуры в ортопедической хирургии. Автологические костные трансплантаты (например, iliac crest) и аллогенные трансплантаты ранее использовались клинически [3,4Однако оба подхода имеют существенные недостатки.Автологическое пересаживание ограничено ограниченным количеством доноров и сопряжено с риском дополнительной заболеваемости в месте сбора из-за вторичной хирургии [6]. Аллогенные трансплантаты также связаны с значительным иммунологическим отторжением и высокими показателями неудачи [7].Были разработаны стратегии по инженерии костной ткани (BTE)., интегрируя скелеты, клетки и биоактивные сигналы для улучшения остеогенеза, сосудистости и осаждения матриц [8,9,10]. Scaffolds used in BTE with porosity levels exceeding 50% and pore sizes ranging between 200 and 500 micrometers play a pivotal role not only in promoting osteoinduction and osteoconduction but also in serving as effective 3D matrices that facilitate cell adhesion, пролиферация и отложение внеклеточной матрицы (ЭКМ) в месте повреждения [6, 11,12,13В последние годы аддитивное производство на основе экструзии, известное как моделирование расплавленного отложения, стало инновационным методом изготовления лесов с точным архитектурным контролем.Этот метод позволяет контролировать осаждение материала, геометрическая настройка и модификация поверхности, устранение ограничений, связанных с гетерогенностью тканей и сложными потребностями в дизайне.Структурные и биологические характеристики биомиметических скелетов в области костной инженерии значительно улучшены [15].,16,17].

PCL, линейный алифатический термопластичный полиэстер, вызвал значительный интерес в производстве тканевых инженеров из-за его благоприятных свойств, таких как биосовместимость,низкая иммуногенностьПКЛ особенно подходит для долгосрочных применений в БТЭ [18, 19].Низкая температура плавления PCL® повышает его совместимость с печатью на основе экструзии [20]Костные леса, изготовленные из ПКЛ, обеспечивают механическую поддержку и постепенно разлагаются in vivo, избавляя от необходимости вторичных хирургических вмешательств.,Стратегии модификации поверхности, включая плазменную обработку и последующее покрытие коллагеном или ЭКМ-белками,использовались для повышения гидрофильности ПКЛ и улучшения клеточной адгезии и биоактивности., тем самым поддерживая БТЭ [22,23Несмотря на достижения в области биоактивных и механически поддерживающих лесов, имитирующих естественную микросреду костей,Регенерация костей также зависит от биологических сигналов, полученных от клеток и секретируемых ими факторов для производства новых тканей.

Среди них мезенхимальные стромальные клетки (MSC) являются негематопоэтическими, мультипотентными клетками с способностью к самообновлению.необходимы для регенерации костей путем дифференциации на остеогенные линии и паракриновой модуляции окружающей микросреды [25].,26Из различных источников MSC, hEnMSCs стали значительными кандидатами для платформ BTE. hEnMSCs не только демонстрируют классические характеристики MSC, включая клоничность, мультипотентность,и паракриновой активностиИз-за их присущего остеогенного потенциала и чувствительности к раздражителямhEnMSC все чаще используются в качестве модели для оценки новых остеоиндуктивных стратегий [28].,29,30,31].

Помимо клеточного компонента, регенерация костей сильно регулируется сигнальными молекулами, выделяемыми в внеклеточную среду.Экзосомы (Exo) представляют собой наноразмерные внеклеточные пузыри, секретируемые различными типами клеток, которые играют решающую роль в посредничестве межклеточной связи [32]Несмотря на свой небольшой размер (30-180 нм), они транспортируют широкий спектр биоактивных молекул, таких как белки, нуклеиновые кислоты, липиды и метаболиты.которые существенно влияют на межклеточную связь и изменяют поведение и функцию клеток-реципиентов [25].Из-за их низкой иммуногенности, эффективного клеточного поглощения и расширенной системной циркуляции экзосомы стали многообещающими агентами для регенерации костей [34].Эти экзосомы демонстрируют остеоиндуктивные и иммуномодулирующие свойства, что делает их подходящими для применения в качестве скелетов костной инженерии для восстановления дефектов костей критического размера [35,36, 37].

В то время как значительные исследования были сосредоточены на влиянии экзосомов, полученных из MSC, на регенерацию костей,роль экзосом, полученных из альтернативных остеогенных клеточных моделей, в стимулировании остеогенеза не была полностью выясненаВ этом исследовании была исследована способность экзосом, полученных из остеобластов, вызывать остеогенез в контексте БТЭ.Мы разработали 3D-печать пористых PCL лесов, покрытых коллагеном (PCL/Col), которые при включении этих пузырей значительно повышают остеогенную дифференциацию hEnMSC in vitro, даже при отсутствии стандартной остеогенной среды.В результате in vivo-оценки была показана улучшенная регенерация костной ткани.Эти результаты подчеркивают потенциал экзосом-функционализированных безклеточных скелетов в качестве эффективной стратегии для содействия восстановлению костей при дефектах критического размера в модели крыс.

Материалы и методы

Проектирование и изготовление лесов PCL 3D

3D-печать

Изготовление пористых лесов PCL было выполнено с использованием 3D-биопринтера на основе экструзии (BioFabX2, Omidafarinan Co., Тегеран, Иран) и с помощью Repetier Host V2.1Пелеты PCL MW = 80 000 г/моль (440744, Sigma-Aldrich) были загружены в камеру из нержавеющей стали, а шприц нагрели до 110 °C, чтобы получить однородное плавление полимера.Впоследствии PCL для плавления экструдировали через 400 мкм сопла при давлении 4.5 бар со скоростью 3 мм/с. Леса PCL были изготовлены с шириной нити 500 мкм, размером пор 350 мм и высотой слоя 250 мкм, с высотой слоя 0.25 мм и плотность наполнения 55% при использовании схемы размещения 0°/90° (таблица 1)Леса с различной геометрией и размерами были изготовлены для удовлетворения конкретных требований каждого опытного протокола.Дискообразные скелеты, состоящие из четырех слоев (5 мм в диаметре × 1 мм в высоту) были разработаны для оценки in vitro.Для экспериментов на животных in vivo были напечатаны цилиндрические леса с 16-20 слоями, имеющие диаметр и высоту 5 мм.кубические леса были изготовлены для структурной и механической характеристикиДля общей характеристики лесов использовались более мелкие кубики (5 × 5 × 2 мм; 8 × 10 слоев), а более крупные кубические лесовки (10 × 10 × 10 мм);36-40 слоев) были специально изготовлены для механических испытаний..